..
..
.. Print page
Metagenomica analisi dei batteri sui capelli umani
01.06.16

 

una valutazione qualitativa per le applicazioni nel campo della scienza forense

 

Silvana R Tridico12 *, Dáithí C Murray12, Jayne Addison1, Kenneth P Kirkbride3 e Michael Bunce12

 

* Autore corrispondente: Silvana R Tridico silvanatridico@yahoo.com

 

Autore affiliazioni

1 Veterinaria e Scienze della Vita, Murdoch University, Perth 6150, WA, Australia

 

2 Trace e di laboratorio DNA Ambientale, Dipartimento Ambiente e Agricoltura, Curtin University, Perth 6845, WA, Australia

 

3 Facoltà di Scienze Chimiche e Fisiche, Flinders University, Adelaide 5001, South Australia, Australia

 

Per tutte le email di autore, si prega di accedere.

 

Genetica investigativi 2014, 5:16 doi: 10,1186 / s13323-014-0016-5

 

La versione elettronica di questo articolo è quello completo e si possono trovare online all'indirizzo: http://www.investigativegenetics.com/content/5/1/16

 

 

Ricevuto: 18 agosto 2014

Accettato: 13 novembre 2014

Pubblicato: 16 dicembre 2014

© 2014 Tridico et al .; licenziatario BioMed Central Ltd.

Questo è un articolo Open Access distribuito sotto i termini della licenza Creative Commons Attribution (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0), che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che il lavoro originale è opportunamente accreditati. La rinuncia Dedizione Creative Commons Public Domain (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) si applica ai dati messi a disposizione in questo articolo, se non diversamente indicato.

 

astratto

sfondo

Peli di mammifero sono uno dei tipi più diffusi di prova traccia raccolti nel corso delle indagini forensi. Tuttavia, i peli che sono naturalmente capannone o che mancano le radici sono substrati problematici di profili di DNA; questi tipi di capelli spesso contengono DNA nucleare sufficiente a produrre a breve ripetizione tandem (STR) profili. Mentre ci sono stati una serie di indagini iniziali valutare il valore della metagenomica analisi per applicazioni forensi (ad esempio, l'esame di tastiere di computer), non ci sono state valutazioni metagenomiche di umana peli-un substrato comunemente incontrati durante la pratica forense. Questo studio cerca di affrontare questo divario di capacità forense, effettuando una valutazione qualitativa nella applicabilità di analisi metagenomiche di cuoio capelluto umano e peli pubici.

 

Risultati

Quarantadue estratti DNA ottenuti da cuoio e pubici capelli umani hanno generato un totale di 79.766 letture, ottenendo 39.814 letture di controllo post e filtraggio abbondanza. I risultati hanno rivelato la presenza di combinazioni uniche di taxa microbica che può permettere una discriminazione tra gli individui e la firma taxa indigeni peli pubici femminili. Dati microbici da una sola coppia conviventi aggiunto una dimensione supplementare allo studio suggerendo che le analisi metagenomiche potrebbero essere di valore probatorio nei casi di violenza sessuale quando altre prove associativa non è presente.

 

Conclusioni

Di tutti i dati ottenuti da questo studio, il sequenziamento di nuova generazione (NGS) i dati generati dal pelo pubico tenuto il maggior potenziale per le applicazioni forensi. Analisi metagenomica di capelli umani possono fornire dati indipendenti per aumentare gli altri risultati di medicina legale ed eventualmente fornire associazione tra le vittime di violenza sessuale e di colpevole quando altre prove associativa è assente. Sulla base dei risultati carpito nella presente studio, crediamo che con l'ulteriore sviluppo, profiling batterico di capelli diventeranno una preziosa aggiunta al toolkit forense.

 

Parole chiave: Forensic; metagenomica; batteri; Peli del cuoio capelluto; Pubici peli; Aggressioni sessuali; Sequenziamento di nuova generazione; 16S DNA

sfondo

Negli ultimi dieci anni, lo sviluppo di approcci culturali indipendenti batterici (metagenoma), basato su geni 16S rRNA (di seguito denominati 16S), sequenze è diventata la pietra angolare di ecologia microbica [1]. L'avvento di tecnologie e piattaforme in grado di generare milioni di sequenze per campione facilitato valutazioni delle comunità microbiche tra i siti del corpo e gli individui sequenziamento di prossima generazione (NGS) [2], [3]. La maggiore potenza di sequenziamento ha stimolato lo sviluppo di programmi di calcolo robusti in grado di elaborare grandi insiemi di dati di sequenziamento complesse [4] e abilitato analisi filogenetiche di genomi umani e ambientali [5], [6].

 

Studi sul microbioma umano (i genomi collettive presenti nel corpo umano) suggeriscono che ci sono differenze significative nella composizione batterica non solo tra diverse parti del corpo, ma anche tra gli individui [3], [5], [7]. Il potenziale che gli individui possono ospitare specie batteriche uniche rilevante per le indagini forensi.

 

Per secoli, prove capelli associativa basata unicamente sulla microscopia comparativa sulla base di caratteristiche qualitative come il colore e la pigmentazione [8] - [10]. L'avvento della PCR a metà degli anni 1980 ha avviato un cambiamento di paradigma nel esame forense di peli. Per la prima volta, i profili di DNA potrebbero integrare osservazioni microscopiche qualitativi [11]. Tuttavia, il successo della altamente discriminatorio ripetizione breve in tandem (STR) profiling dipende peli recanti radici anagen (crescita attiva) peli che sono ricchi di DNA nucleare (nuDNA) e, in misura minore, peli che sono quiescente (catagen) fase di crescita [12]. Tuttavia, la maggior parte dei peli recuperati nelle indagini forensi sono peli capannone (cioè quelli in fase telogen); questi capelli hanno smesso di crescere e contenere poco o nessun nuDNA [13]. STR profiling di questi radici dei capelli produce tipicamente tracce di, spesso degradati, DNA umano e può richiedere l'uso di strategie di DNA a basso modello e le complicazioni che accompagnano tali approcci [14]. In questi casi, il DNA mitocondriale (mtDNA) analisi viene regolarmente effettuata. Tuttavia, a causa della sua comune eredità matrilineare e natura aploidi, i rendimenti di battitura mtDNA capacità di esclusione modesto, che non ha il potere statistico offerta da STR profili [15]. Tuttavia, basse rese di nuDNA umana da campioni di capelli di medicina legale non equivale all'assenza di altre fonti di DNA che potrebbero aiutare nella individuazione di capelli. Infatti, le analisi metagenomiche di peli inadatti per nuDNA profiling possono fornire una impronta digitale microbica per aumentare altri risultati forensi, come le analisi del DNA mitocondriale. Ciò non comporterebbe procedure di estrazione o supplementari, come le procedure di isolamento del DNA di DNA umano sarà anche 'raccogliere' DNA microbico.

 

Esame convenzionale capelli forense, utilizzando tecniche sia morfologici o molecolari, è subordinata la deposizione e il recupero dei peli; tuttavia, nonostante adagio di Locard che 'ogni contatto lascia una traccia' [16], questo potrebbe non essere sempre così. La ricerca in relazione al trasferimento di peli pubici in indagini forensi che coinvolgono i casi di violenza sessuale scoperto trasferimento limitato (4%), dei peli pubici maschio a zona genitale femminile durante il rapporto sessuale (SI) [17]. Inoltre, il presente studio ha dimostrato che nessun femmina pubica trasferimento capelli genitali maschili avvenuta.

 

L'utilità di metagenomica analisi per applicazioni forensi è stato esplorato dall'inizio della NGS; per esempio, Fierer et al. [18] condotto lavoro preliminare di esplorare il potenziale per collegare gli individui a tastiere e mouse sulla base di trasferimento di batteri della pelle. Tuttavia, uno dei più onnipresente di prove tipo-umano capelli è ancora da valutare nel contesto della metagenomica forensi. Per quanto a nostra conoscenza, questo studio è il primo a valutare qualitativamente la fattibilità di analisi metagenomiche di peli in un contesto forense. I tre obiettivi della ricerca riportata qui erano di valutare:

 

1) Se cuoio capelluto umano e peli pubici possono essere differenziate sulla base delle loro 16S composizione microbica

 

2) Se le persone possono essere differenziate sulla base di taxa microbica colonizzazione del cuoio capelluto e dei capelli pubici

 

3) Se i profili 16S batteriche su alberi capelli sono stabili nel tempo

 

Nel complesso, l'obiettivo di questo primo studio è stato quello di stabilire se l'ulteriore sviluppo della tecnica è giustificata.

 

Metodi

raccolta dei campioni

Comunità batteriche, associati cuoio capelluto umano e peli pubici, sono stati intervistati utilizzando un approccio di sequenziamento multiplex con codice a barre da sette individui caucasici sani di entrambi i sessi (due dei quali erano in una relazione di fatto), di età compresa 23-53 anni. Lo stato di salute di ogni volontario è stato auto-riferito ad ogni singolo affermando che gli antibiotici non sono state prese almeno 8 mesi prima della raccolta di peli utilizzati nello studio. Ogni singolo angolo raccolto un certo numero di peli tagliati dalle zone del cuoio capelluto e pubici, in tre punti temporali, raccolta iniziale oltre a 2 e 5 mesi successivi, indicato come T0, T2 e T5 rispettivamente. La replica è importante in NGS amplicon sequencing flussi di lavoro-a causa della natura investigativa di questo studio e la limitata disponibilità di risorse, abbiamo scelto di indagare più punti di tempo (repliche temporali) al posto di più estrazioni in ogni punto del tempo (campionamento replica).

 

Ogni volontario è stato fornito con un kit di raccolta dei capelli costituito da sacchetti etichettati clip-sigillo di plastica, forbici sterilizzate, etanolo pulire, guanti in lattice monouso e pinze monouso. Peli stati tagliati vicino alla pelle e da approssimativamente la stessa superficie in ogni punto; i volontari sono stati invitati a pulire le forbici con etanolo salviette tra il campionamento per evitare la contaminazione. La logica di separare i capelli vicino alla pelle, piuttosto che strappando i capelli è stato quello di garantire la taxa batterica identificato avevano più probabilità di provenire dal fusto del capello, piuttosto che la pelle. Capelli presi dalla testa sono stati etichettati come i capelli femminili del cuoio capelluto (FSH) o con i capelli del cuoio capelluto maschile (MSH); Allo stesso modo, peli pubici femminili e maschili sono stati segnati peli pubici femminili (FPH) o peli pubici maschile (MPH). Una volta campionato, questi capelli sono stati posti in sacchetti di plastica clip di tenuta separati etichettati e conservati a temperatura ambiente dopo essere stato catalogato. Capelli sono stati campionati e lavorate entro 24 ore dalla raccolta, e campioni di capelli non utilizzati sono stati restituiti al loro confezione originale e conservati a temperatura ambiente; questi capelli non sono stati ulteriormente esaminati o campionati. L'effetto di condizioni di conservazione e di batteri non era nel campo di applicazione della presente studio; tuttavia Lauber et al. [19] hanno studiato gli effetti delle condizioni di conservazione su batteri e ha concluso che la composizione batterica comunità è influenzata nel breve termine.

 

Ogni volontario è stato reso consapevole della natura dello studio e ha dato, il consenso informato scritto. Le informazioni relative alle abitudini sessuali o orientamenti dei volontari non è stata chiesta. Il progetto è stato approvato da, e condotto in conformità con le politiche, Murdoch University Human Research comitato etico e linee guida (progetto numero 2011/139).

 

Estrazione del DNA e quantificazione

Tre peli di ogni zona del corpo sono stati tagliati in circa 1 cm di lunghezza e inseriti in provette da 1,5 ml Eppendorf. Il contenuto di ogni tubo sono stati digeriti durante la notte con 1 ml di capelli digerire tampone contenente: 10 mM Tris pH 8 (Sigma, St. Louis, Mo, Stati Uniti d'America), NaCl 10 mM (Sigma), 5 mM CaCl2, (Sigma), 2.5 mM EDTA pH 8 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 1 mg / ml Prok (AMRESCO, Solon, OH, USA), 40 mm DTT (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 2% SDS (Invitrogen) e acqua MilliQ (Sigma) per rendere il volume residuo. I campioni, compresi i controlli ambientali di estrazione e di laboratorio, sono stati garantiti su bracci rotanti (per garantire la totale immersione) e digerito notte in un forno a 55 ° C.

 

Tutti i campioni sono stati poi centrifugati per 2 min a 13.000 rpm. Per concentrare il DNA, per un totale di 600 ml di surnatante è stato trasferito al Vivaspin colonne ultrafiltrazione di spin con un taglio di 30.000 MW (Sartorius Stedim Biotech, Göttingen, Germania) e centrifugato a 30.000 rpm lasciare 50-100 ml di surnatante. Surnatante concentrato è stato successivamente combinato con cinque volumi di tampone PB (Qiagen, Valencia, CA, USA) e trasferito in una colonna di spin di silice Qiagen e centrifugato a 13.000 rpm per 1 min. Due fasi di lavaggio seguiti (Qiagen AWI tampone e tampone AWII) prima eluizione del DNA dalla colonna con 60 ml di 10 mM Tris-Cl tampone di pH 8. Gli estratti di DNA sono stati successivamente quantificate tramite real-time PCR quantitativa (qPCR; Applied Biosystems StepOne, Foster City, CA, USA) con SYBR green e batterica 16S F515 / BacT 16S (loop V4) _R806 primer (Tabella 1).

 

Tabella 1. Dettagli di primer utilizzati nella amplificazione della regione 16S RNA batterico genoma mitocondriale

Estratti sono stati analizzati utilizzando qPCR per estratti ordinate oltre a 1/10 e 1/100 diluizioni, al fine di determinare se estrazioni avuto successo e identificare campioni con bassa DNA stampo (definiti come quelli con valori CT> 32). L'eventuale presenza di inibitori della PCR è stato anche determinato dalla qPCR. Il dosaggio 16S qPCR è stata condotta in 25 microlitri reazioni utilizzando una miscela master 2X ABI alimentazione SYBR (Applied Biosystems) con 2 ml di DNA estratto con concentrazione dei primer a 0.4 mM (IDT) ciclato per 95 ° C per 5 minuti, seguito da 50 cicli di 95 ° C per 30 s, 55 ° C per 30 s, 72 ° C per 45 s, con 1 ° C fondere gradino e una estensione finale di 10 min a 72 ° C. La concentrazione ottimale del DNA libero di inibizione è stato utilizzato per tutte le analisi successive. Ogni campione di capelli estratto batterico aveva CT valori inferiori a 32 cicli di PCR che indicano la presenza di sufficiente numero di copie 16S modello per robusto NGS amplicon sequencing.

 

Fusion-tagged generazione 16S V4 Amplicon

F515 batterica e R806 (Tabella 1) 16S primer (targeting per regione V4) utilizzata nella schermata iniziale estratto qPCR, dando un meno formato del prodotto variabile primer di ~ 250 coppie di basi, sono stati modificati in primer di fusione per la produzione di prodotti per la successiva ampliconi sequenziamento. Ogni iniettore fusione consisteva di un GS FLX Titanium (Lib-A) Adattatore A o B sulla 'fine seguito da un unico identificatore 6 bp multiplex (MID) tag e il modello specifico avanti o indietro innesco al 3' del 5 fine primer [22] che dà una dimensione prodotto variabile finale ~ 350 bp tra cui primer e integrazioni. Un passo singolo, fusion univoco tag approccio PCR è stata impiegata per minimizzare la contaminazione associato con i passaggi multipli PCR utilizzati in NGS flussi di lavoro [20].

 

Per ogni punto di tempo, ogni estratto è stato assegnato un 6 bp MID-tagged fondo fusione in preparazione per amplicon sequencing. Ampliconi MID-targhette sono stati generati in triplice copia (es PCR replica) in 25 microlitri reazioni contenenti: 1X PCR Buffer Oro (Applied Biosystems), 2.5 MgCl2 mm (Applied Biosystems), 0,1 mg / ml BSA (Fisher Biotech, WA, Australia), 0,25 mm di ogni dNTP (Astral scientifico, NSW, Australia), 0,4 micron di avanti e indietro di primer (IDT), 0.2 μL1 unità di DNA polimerasi Taq (AmpliTaq Gold ™), 1: 80.000 (concentrazione finale) di gel SYBR Green '-stain '(life Technologies, S7563, Carlsbad, CA, USA) ed estratto di DNA. Gli stessi processi sono stati eseguiti su PCR controlli negativo / reagenti per ogni corsa piastra PCR, oltre pre- e post di estratti di DNA.

 

Tutti ampliconi della PCR sono stati purificati mediante il protocollo di purificazione Agencourt AMPure XP ™ Bead PCR (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA, USA). Al solo scopo di copertura di sequenziamento, sono stati purificati ampliconi elettroforesi su gel di agarosio 2% per ottenere rapporti approssimativamente equimolari di ciascun campione. Dove estrazione / controlli ambientali o PCR controlli negativo / reagenti hanno mostrato risultati positivi qPCR, questi sono stati anche riunite, purificati e sequenziati. La biblioteca finale aggregata è stata quantificata utilizzando qPCR per determinare il volume appropriato di libreria da utilizzare per emulsione PCR (emPCR) prima di amplicon sequencing sul GS Junior ™ (descritto in Murray et al. [21], con condizioni di reazione in Murray et al . [23]). Tutti emPCR, recupero tallone e le procedure di sequenziamento ampliconi sono state effettuate secondo protocolli Roche GS Junior ™ per amplicon sequencing (Lib A).

 

L'analisi bioinformatica

Sequenza Amplicon letture ottenute dal GS-Junior ™ (di seguito denominato sequenze) sono stati ordinati in lotti basate su tag MID assegnati a ciascun estratto consentendo disallineamento a metà sequenze di DNA tag. Inoltre, 16S specifici template sequenze primer batteriche sono state annotate e tagliati da tutte le sequenze che consentono di disallineamento in composizione base o lunghezza della sequenza primer. Sequenze che non hanno rispettato i criteri sono stati scartati. I passaggi di cui sopra sono stati condotti utilizzando Geneious ™ v7.0.6 [24].

 

Una volta in batch e tagliati, sequenza file FASTA sono stati importati in QIIME v1.8.0 [25] e fusi in un unico file FASTA. Sequenze chimerici sono stati individuati e rimossi in base al singolo campione utilizzando il usearch61 [26] de novo metodo passaggio --split_by_sampleid. A seguito di questo, unità tassonomiche operative (Otus) sono stati identificati utilizzando un metodo di raccolta di riferimento aperto OTU utilizzando usearch61 con un raggruppamento di identità del 97%, utilizzando la sequenza più abbondante all'interno di ogni OTU come la sequenza di rappresentante e il database di rilascio Greengenes 13.8 [27]. Sequenze rappresentante per ciascun OTU sono state allineate con PyNAST [28] contro la Greengenes 13,8 database di pre-allineati, l'allineamento filtrata e filogenesi costruito utilizzando FastTree [29] in QIIME. Inoltre, qualsiasi OTU trovato nei campioni di controllo di punti temporali specifici (cioè T0, T2, T5) sono stati rimossi da campioni contenuti nel rispettivo punto di tempo. Dopo l'eliminazione del controllo OTU, ogni singolo campione è stato filtrato per rimuovere basse abbondanti cluster OTU. In ogni caso, tutte singoletto OTU stati scartati e ogni OTU cui abbondanza era inferiore allo 0,2%, un tasso di errore stimato associato 454 sequenziamento [30], del numero totale di sequenze filtrati in quel campione è stato rimosso. OTU restante post-filtraggio sono stati identificati tassonomicamente utilizzando l'opzione BLASTN entro sceneggiatura tassonomia assegnazione del QIIME nel database Greengenes 13.8. Inoltre, sono stati OTU tassonomicamente assegnati utilizzando RDP [31] e [26] UCLUST opzioni, ancora una volta contro il database Greengenes 13.8 [27].

 

Per determinare a livello lordo, se ci fosse il clustering dei campioni in base al sesso e / o di origine somatica, un principale un'analisi coordinata (PCoA) plot è stato costruito utilizzando sequenze filtrati negare o meno sequenze erano parte del microbioma nucleo.

 

Dopo l'identificazione tassonomica e PCoA costruzione, il microbioma di base per ciascun sesso / origine somatica (SSO) raggruppamento (cioè FSH, FPH, MSH e MPH) è stato determinato utilizzando QIIME. Il microbioma 'core' è stata definita in accordo con quanto stabilito dalla Ombra et al. [32], tutto OTU che si verificano in due o più (cioè la maggioranza) dei punti temporali registrati per ciascuno dei raggruppamenti SSO. Qualsiasi OTU di che si verificano solo in uno dei tre punti di tempo è classificato come 'transitorio' (Tr). In aggiunta a questo, il numero di OTU che erano unico per un individuo è stato determinato; questi sono stati definiti come tutti OTU verificano unicamente in tale individuo attraverso almeno due punti di tempo indipendentemente dal fatto che è risultato essere un nucleo OTU nei raggruppamenti SSO sopra. Dopo identificazione di OTU personalizzato, si è determinato se o meno il detto OTU verificato in capelli pubici, cuoio capelluto o in entrambi. Infine, il numero di OTU condiviso solo da due individui sono stati identificati per esaminare se il numero di OTU tra la coppia convivente è stata maggiore rispetto agli altri partecipanti non conviventi.

 

Risultati e discussione

Quarantadue pool di estratti di DNA ottenuti da cuoio capelluto umano e peli pubici sono stati usati per interrogare la loro composizione microbica dal sequenziamento di prossima generazione. Un totale di 79.766 letture sono stati generati, ottenendo 39.814 letture di controllo post e filtraggio abbondanza. In media, la copertura per campione era 1.899 letture pre-filtrata e 948 post-filtrato. Anche se questa profondità di copertura è meno che ideale dato il progresso della tecnologia NGS (cioè piattaforme Illumina e Ion Torrent), questi dati 454 sono ancora sufficienti per esplorare il potenziale di medicina legale capelli microbici per lo sviluppo futuro. Come tutte le nuove tecniche di polizia scientifica, analisi metagenomiche di peli in definitiva richiede la valutazione robusta e validazione atto a garantire che queste analisi siano adatti allo scopo e in grado di resistere a un esame scientifico. Parte di questo convalida dovrebbe prendere in considerazione: la replica (spaziale, temporale e PCR replica); persistenza di batteri capelli, non solo una volta che vengono trasferiti o depositati (durante il contatto e la stabilità durante la conservazione) e la prevenzione della contaminazione durante la lavorazione peli in laboratorio. Budowle et al. [33] contorno e discutere in dettaglio i futuri criteri di convalida per le analisi metagenomiche in relazione alle applicazioni forensi microbiche, che credono richiederà partecipazione internazionale. Tuttavia, una simile impresa è oltre la portata di questa valutazione iniziale in solo una delle tante applicazioni di indagini metagenomiche forensi.

 

Ci sono molti modi per presentare i dati metagenomiche quali generati qui; sezioni sotto esplorano i dati utilizzando PCoA, tassonomia e OTU di focalizzazione sul valore dei dati in applicazioni forensi. OTU tassonomicamente assegnato tramite RDP o le opzioni UCLUST rivelato poca o nessuna differenza di assegnazione al rango di famiglia. Per questo motivo, tutte le assegnazioni si riferiscono a BLAST assegnazioni tassonomici.

 

Principal coordina trama

Di tutti i dati ottenuti da questo studio, i dati generati da NGS peli pubici tenuto il maggior potenziale per le applicazioni forensi. Una dicotomia generale è stata osservata tra taxa (OTU) attraccato sulla alberi peli pubici maschili e femminili (Figura 1).

 

trame (PCoA) coordinare thumbnailFigure 1. Principal. Clustering di taxa microbica da ogni individuo in ogni punto di raccolta. Il cerchio lilla rappresenta sequenze batteriche postali-SI, mentre i cerchi blu e giallo pallido rappresentano non-SI-sequenze sia batteriche cerchi si riferiscono esclusivamente alla coppia conviventi. Panel A rappresenta peli pubici taxa microbica da Male (arancione) e (RED) partecipanti di sesso femminile. Pannello B rappresenta capelli del cuoio capelluto taxa microbica da Male (verde) e (blu) partecipanti di sesso femminile. Panel C rappresenta taxa microbica presente nel maschio e cuoio femminile e campioni di peli pubici.

In generale, i maschi erano raggruppati vicino all'asse PC2 lungo l'asse PC1, mentre le femmine sono più uniformemente distribuite lungo l'asse PC1 e in seguito dall'asse PC2 rispetto ai maschi. I dati relativi alle due persone, che erano una coppia convivente, ha presentato alcuni risultati interessanti. I punti rossi nella dell'ellisse gialla ad alta PC1 rappresenta la taxa presenti sul partner femminile della coppia a T0 e T2, mentre i due puntini arancioni racchiusi da piccoli cerchi blu a bassa PC1 rappresentare il taxa dal partner maschile a T0 e T2. Il cerchio lilla racchiude un punto rosso (taxa dalla femmina a T5) e uno arancione punto (taxa dal maschio a T5). Taxa microbica estratta dal maschio e femmina a questo punto di tempo erano più simili tra loro rispetto alle loro altre punti temporali precedenti (T0, T2). Indagini Discreet rivelato, a differenza dei punti di tempo precedenti; la coppia in questione era impegnato in un rapporto sessuale prima della raccolta di campioni di capelli T5. È interessante notare che il rapporto sessuale era avvenuta 18 ore prima della raccolta di peli pubici e sia per gli individui aveva la doccia nel periodo intermedio. Cross-trasferimento di batteri durante il rapporto sessuale può spiegare la variazione di taxa osservata. Cross-transfert, o spargimento di pelle microflora, non è raro per gli individui che condividono vivere o spazi comuni [34] o durante gli sport di contatto, in cui Prato et al. [35] osservare 'I nostri risultati sono coerenti con l'ipotesi che gli umani spostamenti microbioma pelle della composizione durante le attività che coinvolgono umana al contatto umano'. I risultati che presentiamo qui suggeriscono che il microbioma pelo pubico potrebbe essere abbastanza stabile, anche durante la convivenza, ma potrebbe essere spostata drammaticamente durante il rapporto sessuale per qualche tempo. Questo studio è il primo a suggerire cross-transfert pubica / genitale taxa microbica come risultato del rapporto. Anche se ulteriori analisi devono essere realizzati, questo risultato iniziale fa ben sperare per le applicazioni forensi future che coinvolgono i crimini sessuali.

 

Un ulteriore vantaggio è che, rispetto ad altre zone del corpo, come la pelle, tratto gastrointestinale (GIT) e la bocca, un minor numero di specie batteriche sembrano comprendere il microbioma vaginale [36]. Il vantaggio delle comunità più semplici e meno taxa del microbioma vaginale è uno che può agevolare le indagini forensi, fornendo i risultati in modo tempestivo.

 

I chiara distinzione tra microbiche peli pubici delle sessi possono in gran parte essere attribuibile alla prevalenza di Lactobacillus spp. nei campioni di capelli pubici femminili e l'assenza di tali batteri in campioni maschili (eccetto il convivente maschio a T5) (Figura 1). Inoltre, maschio peli pubici taxa microbica sono stati raggruppati lungo l'asse PC2 suggerendo che questi taxa (OTU) erano comuni al microbiota maschile.

 

Al contrario, i peli pubici femminili taxa batterica ha mostrato allungamento lungo gli assi PC1 e PC2. L'allungamento dei dati lungo PC1 può essere attribuibile alle femmine che ospitano diverse specie di lattobacilli (Tabelle 2 e 3). Tuttavia, l'allungamento concomitante di dati lungo l'asse PC2 suggerisce la presenza di differenze secondarie, differenze che possono essere dovuti alla presenza di taxa personalizzato (Tabella 3).

 

Tabella 2. condiviso taxa di confronti a coppie di tutti i dati si trovano in cuoio (Sc) e / (PU) peli pubici o

Tabella 3. personalizzato (unico) taxa batterica colonizzazione del cuoio capelluto maschile e femminile e peli pubici

La trama PCoA di maschio e femmina microbiota capelli del cuoio capelluto durante il periodo di tempo di 5 mesi non ha dimostrato alcuna significativa di clustering (Figura 1). Questo è più probabile attribuibile a peli di cuoio capelluto maschile e femminile ospitano taxa batterica simile. Tuttavia, alcuni dei taxa femminile sono leggermente sparsi lungo l'asse PC1 suggerisce che ci può essere qualche variazione in taxa microbica nei peli di questi individui. La distribuzione e la composizione delle comunità microbiche colonizzatori cuoio capelluto e dei peli pubici è discusso in dettaglio qui di seguito.

 

microbiota capelli

I batteri colonizzare cuoio capelluto maschile e femminile e di campioni di capelli pubici sono classificati come 'core' o transitori (Tr) batteri (Figura 2, consultare la sezione 'Metodi'). In relazione al numero di OTU estratte dal cuoio capelluto e microbiomes peli pubici, di gran lunga meno sequenze batteriche sono stati persi filtraggio per microbiomes pubici rispetto al cuoio capelluto controllo post. Peli pubici in generale contenevano più OTU di capelli del cuoio capelluto (circa il 50 maschile OTU / 55 femminile per capelli del cuoio capelluto cf circa 73/76 per peli pubici). Pertanto, in generale, microbiomes peli pubici sembrano essere meno influenzato da batteri ambientali che i capelli del cuoio capelluto e dei possibili specifici batteri porto più di nicchia. Zhou et al. [37] sostengono questa premessa dimostrando che (in confronto ad altre zone del corpo) microbiota vaginale costituito da batteri meno stabili (cioè batteri più transitori) e ha mostrato la diversità inferiore alpha (cioè specie di basso ricchezza di), sostenendo la premessa di peli pubici ospitare batteri specifici di nicchia.

 

thumbnailFigure 2. dati microbiche estratti da cuoio e peli pubici. Diagrammi che illustrano core e transitoria (Tr) taxa batterica sul cuoio capelluto maschile e femminile e campioni di capelli pubici.

Peli microbiota capelli

Maschio peli pubici potrebbero essere facilmente distinti da peli pubici femminili sulla base dei rispettivi microflora. Lactobacillus era taxon più prevalente che chiaramente differenziato maschio e femmina microbiota pube (Figura 2). Mentre la prevalenza di Lactobacillus spp. nelle secrezioni vaginali e vaginali è ben consolidata [38] - [40], questo studio è il primo a discutere di questi batteri colonizzano peli pubici, e la zona pubica generale, nel contesto di valore probatorio in indagini forensi. Fleming e Harbison [41] hanno suggerito la presenza di due Lactobacillus spp. (Lactobacillus crispatus e Lactobacillus gasseri) come marcatori forensi idonei per identificare secrezioni vaginali. Tuttavia, i dati microbiche carpito nella presente studio suggeriscono che un approccio metagenomica NGS può essere preferibile a quelle che colpiscono determinate specie. La varietà di Lactobacillus spp. rilevato in peli pubici dalla coorte femminile composta da 11 OTU (taxa) in totale; tre Lactobacillus spp. erano riservate femmina 5, uno Lactobacillus spp. verificato femmina 1 e quattro Lactobacillus spp. erano unicamente tra la coppia convivente. Inoltre, due Lactobacillus spp. sono state condivise univoco tra F4 e F5, e uno è stato condiviso OTU univoco tra F4 e F1 (Tabelle 2 e 3).

 

Rispetto ai peli pubici maschili, peli pubici femminili ospitavano un numero inferiore di batteri transienti (figura 2); il numero di sequenze batteriche comprendente batteri transienti di peli pubici femminili era circa la metà del numero di quelle che si trovano nei capelli pubici maschio (Tabella 4). Questa disparità può essere attribuibile a lattobacilli conferire 'protezione antimicrobica' alla vagina impedendo la colonizzazione da parte di altri microrganismi [38]. Li et al. [42] ha anche scoperto che, rispetto ad altre zone del corpo, il microbioma vaginale è meno transitoria (cioè più stabile). Questa stabilità era evidente nelle differenze tra il numero di OTU rilevato nel cuoio capelluto e dei capelli pubici controlli; vi erano significativamente meno OTU presenti nei controlli dei peli pubici rispetto ai peli cuoio capelluto. Il controllo post filtraggio per FSH e campioni MSH ci sono stati il 33% e il 43% (rispettivamente) di sequenze a sinistra. In confronto, per FPH e MPH c'erano il 70% e il 72% (rispettivamente) le sequenze di sinistra, post-filtraggio. La disparità tra le due origini somatiche suggerisce che il taxa batterica negli estratti cuoio capelluto aveva una percentuale di batteri ambientali che appaiono facilmente nei controlli.

 

Tabella 4. Numero di 16S batteriche sequenze presenti in microbiomes fondamentali rispetto al numero transitorio di sequenze per ciascun sesso / origine somatica campionato

Capelli del cuoio capelluto microbiota

In contrasto con i peli pubici, cuoio capelluto microbioti mostrato alcuna correlazione con il sesso del donatore (Figura 2). Maschio e femmina capelli del cuoio capelluto taxa batterica composta da normali commensali della pelle umana, ad esempio, Anaerococcus spp., E taxa derivati ambientale, ad esempio, Knoellia subterranea, molti dei quali si è verificato sia in maschi e femmine campioni (Tabella 5). Nel presente studio, la differenza più significativa osservata in peli di cuoio capelluto maschili e femminili erano le proporzioni disparati del taxa batterica transitoria (Figura 2). Quasi il doppio rispetto taxa batterica transitoria erano presenti in capelli del cuoio capelluto femminile rispetto ai maschi (Tabella 4). Ciò può essere dovuto alla maggiore frequenza di femmine governare e / o di lavaggio e / o la tintura o decolorazione i capelli rispetto ai maschi. Tali pratiche governare potrebbero impedire creazione di colonie batteriche più stabili a favore dei meno stabili (transitorio) colonie batteriche. Indipendentemente dalla causa di questa disparità, questa osservazione non può essere considerato significativo in relazione alle indagini forensi.

 

Tabella 5. habitat naturali di taxa batterica condivisa identificati da confronti a coppie

Costello et al [3] ha individuato due 16S sequenze dominanti da tamponi del cuoio capelluto:. Propionibacterinae in cui i membri sono batteri predominanti nei follicoli dei capelli e altri siti sebacee [39] e Streptophyta (un phylum pianta). Al contrario, i taxa batterica predominante dal fusto del capello in questo studio erano Corynebacteriaceae e Tissierellacea fam.nov ('nuova famiglia') (Figura 2).

 

 

 

 

Conclusioni

 

 

 

 Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione.

 

 

Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

 

Ringraziamenti

 

 

Riferimenti